Od chvíle, kdy Selene se svým lidsko-lykanským milencem Michaelem zničili prastarého upíra Marcuse ve filmu Underworld: Evolution, uběhlo již patnáct let. V jejich průběhu lidstvo odhalilo existenci jak upírů, tak lykanů, a rozpoutalo válku s cílem obě rasy vyhladit. Selene, která byla v průběhu genocidy zajata, se po více než deseti letech probouzí jako vězeň v neprodyšně uzavřené laboratoři společnosti Antigen, mocné korporace, která se snaží vyvinout vakcínu proti virům, jenž mají na svědomí existenci upírů a lykanů.